Паводле легенды царква была пабудавана на тым самым месцы, дзе ў XIV стагоддзі былі забітыя тры дружынніка вялікага князя літоўскага Альгерда: Антоній, Ян і Яўстафій. Яны былі павешаны ў дубовым гаі, дзе пакаралі смерцю злачынцаў за тое, што тыя прынялі хрысціянства і адкрыта прапаведавалі яго сярод паганскага насельніцтва Літвы. Праз некалькі гадоў праваслаўныя хрысціяне сталі збірацца тут на малітвы. Неўзабаве колькасць паломнікаў значна ўзрасла і тады было вырашана пабудаваць невялікую капліцу, пазней узвялі драўляную царкву ў імя Святой Тройцы.
Да пачатку XVI стагоддзя Царква Святой Тройцы прыйшла ў заняпад, струхлела і ператварылася ў разваліны. У 1516-ым годзе Вялікі князь літоўскі Жыгімонт I дазволіў гетману Канстанціну Астрожскаму знесці рэшткі былой драўлянай царквы і пабудаваць новую каменную праваслаўную ў знак падзякі за перамогу ў Аршанскай бітве 1514 года. Канстанцін Астрожскі царквой не абмежаваўся і ўзвёў побач з ёй аднайменны манастыр.
У 1608-ым годзе царква Святой Тройцы была перададзена уніятам. Яны, у перыяд з 1622-1624 год, да бакавых фасадаў прыбудавалі яшчэ дзве капліцы і рызніцу. Акрамя таго, справа ад уваходу, на сродкі віленскага ваяводы Я.с. Тышкевіча, дадаткова ўзвялі капліцу, якую асвяцілі ў гонар Пакрова Прасвятой Багародзіцы.
У 1706-ым годзе царква моцна пацярпела ад пажару, асабліва пабудаваная злева ад уваходу капліца Ушэсця Святога Крыжа, якая была прыстасаваная пад жаночы ўніяцкі манастыр. Праз 42 гады ў 1748-ым годзе царква Святой Тройцы зноў гарэла і пасля, у 1761-ым годзе, па праекце Віленскага архітэктара Яна Крыстафера Глаўбіца была адрэстаўраваная ў барочным стылі. А ў 1792-ым годзе абнавілі бакавыя фасады, замест заходняй сцяны зрабілі прыбудову, якая істотна павялічыла даўжыню царквы.
Наступныя рамонтныя работы ў царкве Святой Тройцы праводзіліся ўжо пад кіраваннем праваслаўнага духавенства, якой яна была перададзена ў 1839-ым годзе. У перыяд з 1851 па 1852-ы год за рамонт адказваў архітэктар М. Празараў. У 1869 годзе па праекце архітэктара М. Чагіна перабудавалі фасада. У 1878-ым годзе на завяршэнні заходняй сцяны ўзнялі дзве вежкі.
У наш час храм уяўляе ансамбль будынкаў, які ўключае ў сябе фрагменты готыкі, барока, класіцызму. Першапачаткова будынак царквы Святой Тройцы ў плане меў амаль квадратную форму, па кутах якой размяшчаліся вежы. Сцены ўзмацнілі контрфорсамі, а аспіды і ўсходнія вежы ўпрыгожылі арачным поясам. Для будаўніцтва царквы выкарыстоўвалася цэгла цёмна-чырвонага і жоўтага колеру, укладвалі яго па гатычнай тэхніцы. Побач з царквой, на паўночным захадзе, стаіць Званіца, уваход у якую размешчаны на значнай вышыні, што, зразумела, сведчыць аб абарончым прызначэнні гэтай пабудовы.
На сённяшні дзень Царква Святой Тройцы ў Вільні належыць уніяцкай царкве. Набажэнствы ў ёй праходзяць на ўкраінскай і беларускай мовах.